2015届 分类号：O622.5 单位代码：10452
毕业论文
多肽的固相合成及固相反应在多肽合成中的应用
姓 名 薛立英 学 号 201110830203 年 级 2011级 专 业 制药工程 系 （院） 药学院 指导教师 李振 李冀伟
2015年4月10日
摘 要
为研究多肽的固相合成工艺，并为工业化合成目标多肽提供理论依据。本实验采用Fmoc固相合成法，以2-Cl-Trt树脂作为固相载体，以FMOC-L-LYS(Boc)-OH、FMOC-L-ALA-OH和FMOC-L-PRO-OH为原料合成目标产物五肽，将反应时间和反应温度作为控制反应的条件。实验得出最适合的合成条件为，0℃投入反应，在室温下分别搅拌5 h，过夜；目标产物五肽的最终纯度可达100.0%。该合成方法操作简便、产率高，可用于工业化合成多肽。
关键词：2-Cl-Trt树脂；固相载体；FMOC-L-LYS(Boc)-OH；FMOC-L-ALA-OH；有机合成；FMOC-L-PRO-OH
ABSTRACT
To study the artwork of solid phase synthesis of polypeptide,and to provide the theoretical basis for industrialization synthesis of objective polypeptide.Using Fmoc solid phase synthesis
method,with
2-Cl-Trt
resin
as
solid
phase
carrier,and
with
FMOC-L-LYS(Boc)-OH、FMOC-L-ALA-OH and FMOC-L-PRO-OH as raw material to synthesis of target products.The orthogonal experiments were put forward by discussing and comparing some reaction conditions such as time and temperature.Results:Optimal conditions:0℃in reaction,respectively mixing five hours,at room temperature for the night.This method is easy to operate and has high product rate,can be applied on the large scale.
Key words: 2-Cl-Trt resin;solid phase carrier;FMOC-L-LYS(Boc)-OH;organic synthesis;FMOC-L-ALA-OH;FMOC-L-PRO-OH
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目 录
1 引言 ........................................................ 1 2 实验部分 .................................................... 2 2.1 主要试剂、仪器和其他物品 ................................. 2 2.1.1 实验试剂 ............................................. 2 2.1.2 实验仪器 ............................................. 3 2.1.3 其他物品 ............................................. 3 2.2树脂的选择 ............................................... 3 2.3 合成方法 ................................................. 3 2.3.1 总反应方程式 .......................................... 3 2.3.2 以 FMOC-L-LYS(Boc)-OH为起始原料 ...................... 4 2.3.3 以FMOC-L-ALA-OH为原料 ................................ 4 2.3.4 以FMOC-L-PRO-OH为原料 ................................ 4 2.3.5 树脂的切割............................................ 5 2.4 LC-MS检测分析 ........................................... 5 3 结果与讨论 .................................................. 5 3.1 图谱分析 ................................................. 5 3.2 讨论 .................................................... 12 4 结语 ....................................................... 12 参考文献 ..................................................... 13 谢辞 ......................................................... 14
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1 引言
多肽是一种涉及生物体内各种细胞功能的生物活性物质，它是由多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合而成，其分子结构介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物。到目前为止，人们已经发现和分离出存在于人体的肽大约有一百多种，对于多肽的研究和利用，已到了史无前例的高度。多肽的合成主要是指化学合成法，其中最主要的合成方法是液相合成和固相合成。现在，化学合成多肽的技术无论是固相法还是液相法都已经成熟。而且近年来，固相法合成多肽凭借其节省时间、物力、原料，易于用计算机分析，易于推广普及等显著优势而成为合成多肽的常用方法并扩展到其它有机物合成的领域
。
多肽固相合成法[1]—英文解释：solid phase peptide synthesis 简写为SPPS。多肽合成研究已经有一百多年的历史了。此方法起于1902年，但到了20世纪50年代，有机化学家们合成了大量的生物活性多肽，例如胰岛素、催产素等，同时在多肽合成方法以及选择合适的氨基酸保护基上面也取得了不少的成绩，这为后来的固相合成方法的出现与发展提供了实验和理论基础。1963年，Merrifield首次提出了固相多肽合成方法并迅速成为合成多肽的首选方法。但在合成多肽的过程中，由于氨基酸的侧链功能团易带来一系列的的副反应和消旋化，所以一般需要用适当的保护基将侧链基团暂时保护起来。目前固相合成多肽主要用两种保护基[16]：Boc（叔丁氧羰基）保护基和Fmoc（9-芴甲氧羰基）保护基。其中α-氨基用Boc（叔丁氧羰基）保护的称为Boc固相合成法，α-氨基用Fmoc（9-芴甲氧羰基）保护的称为Fmoc固相合成法。而且这两种方法在固相合成树脂，多肽缩合试剂以及合成环肽的氨基酸正交保护上均取得了丰硕的研究成果。
多肽合成其实就是一个重复添加氨基酸的过程，合成一般从羧基端（C端）向氨基端（N端）合成。过去的多肽合成都是在溶液中进行的，但自从成功发展了固相多肽合成方法以来，经过几十年不断的改进和完善，到现在固相合成法已经成为合成多肽和蛋白质的一个常用方法，它的许多方面是传统液相合成方法无法做到的。固相合成多肽的基本原理是[17]：以不溶性高分子树脂作为固相载体，首先在固相载体上以共价键连接一个含有被封闭基团保护的氨基的氨基酸，然后以三氟乙酸作为脱保护剂，脱掉氨基的保护基，这样在固相载体上就连接上了第一个氨基酸。将上了保护基的第二个氨基酸的羧基通过用过量的活化羧基组分活化，羧基被活化的第二个氨基酸再与已接在固相载体上的第一个氨基酸的氨基反应形成肽键，这样在固相载体上就生成了一个带有保护基的二肽。重复（缩合→洗涤→去保护→中和和洗涤→下一轮缩合）操作，使肽链从C端向N端生长，直至达到所需要的肽链长度。最后用三氟乙酸将合成好的多肽从树脂上切割下来。
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与液相合成多肽的方法相比，固相合成法合成多肽所具有的显著优点是[7~10]：操作简单，大大简化了后处理操作的步骤；由于反应在单口烧瓶等玻璃容器中便可进行，便于控制反应条件，还可避免因物质的多次转移而造成的损失；使用的反应物需过量，使反应完全，减少副产物，使得目标产物得到高产率和高纯度；与固相载体以共价键相连的肽链比较稳定，可以通过抽滤、洗涤来完成中间产物的纯化，可以避免液相法合成多肽中复杂的步骤，避免分离纯化中间产物时而造成的损失；增加溶剂化效率，减少中间产物的损失；能防止肽的重叠。
虽然采用固相法合成多肽已经有40多年的历史了，然而到现在，固相合成多肽仍然存在的许多的局限性[3~6]：固相合成法直接合成的多肽序列短，合成所需时间过长，合成的效率低，使用的试剂毒性较大，产生的副产物不易分离，氨基酸易消旋化，而且合成所需成本过高，所以无法合成肽链较长、相对分子质量较大的蛋白质类物质；由于固相载体上中间合成产生的杂肽无法被分离掉，这样就造成最终产物的纯度有时不如液相合成物的，因此需要通过可靠的分离手段进行纯化。
现在，多肽固相合成法在生物制药工程及蛋白质工程中均有着广阔的发展应用前景。多肽固相合成法在免疫学研究领域、药物研究领域、蛋白质结构研究领域等都呈现着显著的优越性。由于在治疗某些比较棘手的疾病方面，多肽类药物所具有的独特治疗效果，使得越来越多的化学家和医学家来关注和研究，并取得了显著的研究成果。而且现今社会，随着合成技术的不断发展和成熟，合成仪器的不断改进和完善，可以合成蛋白质的范围将不断扩大，合成时间将会显著缩短，合成成本也将会越来越低；同时通过多肽固相合成法，还可以引进稀有氨基酸，从而对新的蛋白质的结构与功能进行研究和探索。
本论文就是采用Fmoc合成法合成多肽，研究了固相合成多肽的实验过程，优化了合成步骤，并对实验结果进行了分析讨论。
2 实验部分
2.1 主要试剂、仪器和其他物品
2.1.1 实验试剂
2-Cl-Trt树脂（美国Aldrich公司）；FMOC-L-LYS(Boc)-OH[9-芴甲氧羰基（叔丁氧羰基）左旋赖氨酸，美国Aldrich公司]；FMOC-L-ALA-OH（9-芴甲氧羰基左旋丙氨酸，美国Aldrich公司）；FMOC-L-PRO-OH（9-芴甲氧羰基左旋脯氨酸，美国Aldrich公司）；MeOH（甲醇，上海巴斯夫）；DMF（N，N-二甲基甲酰胺，上海巴斯夫）；20%哌啶-DMF（20%哌啶-N，N-二甲基甲酰胺，上海巴斯夫）；DCM（二氯甲烷，中国医药集团上海化学试剂公司）；HCTU（6-氯苯并三氮唑-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷
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酸酯，上海A.R.吉尔生化有限公司）；HOBt（1-羟基苯并三氮唑，上海A.R.吉尔生化有限公司）；1%TFA/DCM（1%三氟乙酸/二氯甲烷，上海A.R.吉尔生化有限公司）；DIEA（N，N-二异丙基乙胺，上海A.R.吉尔生化有限公司）。 2.1.2 实验仪器
500mL单口烧瓶（北京兴运玻璃仪器制品厂）；磁力搅拌器（上海志威电器有限公司）；磁子(北京市化玻供应公司）；温度计（北京兴运玻璃仪器制品厂）；气球；布氏漏斗（北京兴运玻璃仪器制品厂）；滤纸；抽滤瓶（北京兴运玻璃仪器制品厂）；洗瓶；岛津瓶（日本岛津公司）；LC-MS液质联用仪（LC-20AD，LCMS-2010EV，日本岛津公司）；缓冲球（上海贝凯生物化工设备有限公司）；旋转蒸发仪（BC-R203上海贝凯生物化工设备有限公司）。 2.1.3 其他物品
铝箔；冰；微波盒
2.2树脂的选择
固相载体是将固相合成与其他合成技术分开来的最显著的区别，能用于多肽合成的固相载体必须满足以下的要求[15~17]：⑴载体必须空间位阻小，便于溶剂的渗透，使其可以在不断增长的肽链和试剂之间快速的、不受阻碍的接触；⑵载体上必须有足够的反应位点，能使氨基酸共价连接在这些位点上，并在合成反应结束后，裂解这种共价键，以使得每单位体积的载体给出有用产量的肽，并且必须尽量减少被载体束缚的肽链之间的相互作用；⑶另外载体必须在合成中表现为反应惰性，对合成过程中的物理和化学条件稳定。
固相法合成多肽的高分子载体（树脂）主要有三类[7]：聚丙烯酰胺类树脂、交联聚苯乙烯类树脂、聚乙烯-乙二醇类树脂及衍生物。只有将这些树脂导入反应基团，才能直接连上第一个上了保护基的氨基酸。根据所导入反应基团的不同，又将这些树脂及树脂衍生物分为羧基树脂、氯甲基树脂、氨基树脂或酰肼型树脂。而本文采用的FMOC固相合成法通常选择羧基树脂如王氏树脂作为固相载体，此次用的是2-Cl-Trt树脂。
2.3 合成方法
2.3.1 总反应方程式
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2.3.2 以 FMOC-L-LYS(Boc)-OH为起始原料
其步骤是：将2-Cl-Trt树脂(1.00g，1.00mmol)和DIEA(516mg，4.00mmol)加入到无水的DCM (20mL)中混合，然后将 FMOC-L-LYS(Boc)-OH(1.40g，3.00mmol)溶于无水的DCM (30mL)中，在0℃条件下，将后者加入到前者中，在室温下搅拌5小时。最后，将反应液进行抽滤，滤饼分别用DCM (30mL)，DMF (30mL)，MeOH(30mL)洗涤三次。将上述所得产物中加入含有20%的哌啶-DMF（30mL），在室温下搅拌过夜，以脱掉FMOC保护基。将反应液进行抽滤，滤饼分别用DMF(30mL)，DCM(30mL)洗涤三次，干燥后得到产物A1。（现象：滤液呈黄色，滤液加水有白色沉淀产生。） 2.3.3 以FMOC-L-ALA-OH为原料
其步骤是：将FMOC-L-ALA-OH (933mg，3.00mmol) 加入到无水DMF(20mL)中，混合后将HCTU(1.24g，3.00mmol)，HOBt(405mg，3.00mmol)和 DIEA(516 mg，4.00mmol）的混合液在0℃条件下加入其中，并在室温下搅拌30min。将产物A1（1.00mmol）溶于DMF (30mL)后加入到上述反应液中，室温下搅拌1.5h。当ELSD检测后显示该反应完成，则将反应液进行抽滤，滤饼分别用DCM (30mL)，DMF (30mL)，MeOH(30mL)洗涤三次。称10~20mg吸附在树脂上的样品于微量离心管中，用1%TFA/DCM清洗树脂，抽滤。将滤液进行浓缩，若残渣不溶于甲醇中则采取ELSD来检测反应是否完成。将上述所得产物中加入含有20%的哌啶-DMF（30mL）中，在室温下搅拌过夜。将反应液进行抽滤，滤饼分别用DMF(50mL)，DCM(50mL)洗涤三次，干燥后得到产物A2。 2.3.4 以FMOC-L-PRO-OH为原料
其步骤是：将FMOC-L-PRO-OH(3.00mmol)加入到无水DMF(20mL)中，混合后将HCTU(1.24g，3.00mmol)，HOBt(405mg，3.00mmol)和DIEA(516 mg，4.00mmol）的混合液在0℃条件下加入其中，并在室温下搅拌30min。将产物A2（1.00mmol）溶于DMF(30 mL)后加入到上述反应液中，室温下搅拌1.5h。当ELSD检测后显示该反应完成，则将反应液进行抽滤，滤饼分别用DCM(30mL)，DMF(30mL)，MeOH(30mL)洗涤三次。将上述所得产物加入含有20%的哌啶-DMF（30mL）中，在室温下搅拌过夜。将反应液进行抽滤，滤饼分别用DMF(50mL)洗涤三次，DCM(50mL)洗涤两次，干燥后得到产物A3。 制备产物A4，A5的反应过程与制得A3的操作方法相同。
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2.3.5 树脂的切割
将TFA(1%，10mL)加入到无水DCM（20mL）中，混合后产物A5加入到其中，在室温下搅拌1h。将反应液进行抽滤，然后滤液用与无水DCM（20mL）混合的20%DIEA来中和，测酸碱值，溶液浓缩后既得终产物。
2.4 LC-MS检测分析
本文用LC-MS液质联用仪来检测。色谱条件：流动相（90%甲醇+10%水）；流速（0.2mL/min)；扫描时间（4min)；离子源模式：电喷雾电离（ESI)，正离子模式；质量分析器：三重四级杆。
方法：各阶段均取适量产物于微量离心管中，用甲醇稀释后混匀。取适量于岛津瓶中，送检，进样量为1μL。（图谱见图1、2、3）
3 结果与讨论 3.1 图谱分析
A2的质谱图显示它的M:536.2、M+1:537.2与它的理论分子量相符；液相谱图显示它的积分面积即纯度为98.178%。（见图1）
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图1
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A4的质谱图显示它的M:864.3、M+1:865.3与它的理论分子量相符；液相谱图显示它的纯度为98.694%。（见图2）
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图2
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目标产物五肽的质谱图显示它的M：935.3、M+1:936.3与它的理论分子量相符；液相谱图显示它的纯度为100.000%。（见图3）
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图3
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3.2 讨论
只有上第一个FMOC-L-LYS(Boc)-OH时使用的缩合剂是DIEA，后面上的带有FMOC保护基的氨基酸的缩合剂用的都是HCTU，HOBt，DIEA的混合液，这样可以有效地提高缩合效率。在肽链合成后，与多肽相连的树脂和侧链保护基团可以被切割试剂可以有效地切除。试验中使用的Fmoc固相合成多肽的方法，反应条件比较温和，副反应比较少，而且与以往的研究比较，本实验简化了工艺步骤，优化了反应条件，缩短了反应时间，可用于大量合成多肽。合成的多肽经质谱分析分子量为935.30与理论分子量935.50相一致。由图3可得目标产物五肽的最终纯度可达100.000%。因此可以说明本次实验合成的多肽与理论计算的结果相一致。
4 结语
本论文通过固相载体的选择后以2-Cl-Trt树脂作为固相载体，以FMOC-L-LYS(Boc)-OH为起始原料，以以上各种上了保护基的氨基酸为中间原料合成了一条多肽，并探索了该多肽的性质、合成方法，通过实验研究反应物的加料比、所用溶剂、反应温度等各种因素对反应的影响，确定了此合成反应的较优条件。本文通过探讨多肽的合成方法，成功实现了目标化合物的合成，并通过LC-MS对各步反应产物及目标产物进行了纯度和结构的鉴定。本实验所探索的固相合成多肽的方法将为多肽的进一步研究提供理论依据和实验基础。
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参 考 文 献
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谢 辞
大学生活转瞬即逝，回首过去四年走过的“路”，看过的“风景”，心中倍感充实与怀念。当我写完这篇毕业论文的时候，有一种如释重负的感觉，感慨良多。
首先，诚挚的感谢李振老师。本论文是在李振老师的亲切关怀和悉心指导下完成的。他用严谨的科学态度，高要求，给予我实验上精心的指导，同时还在思想上给我以无微不至的关怀。
其次，特别感谢天津药明康德新药开发有限公司的李冀伟师兄给予我实验操作上的指导和其他师兄们的热情帮助。感谢曾经在各个方面给予过我帮助的伙伴们！
再次，我还要向百忙之中抽时间对本文进行审阅和评议的各位老师表示诚挚的感谢，谢谢你们提出的宝贵建议。
薛立英
2015年4月10日
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